CCK8细胞增殖和药物毒性检测实验流程@清泓生物
细胞增殖检测是测定药物效力、评估药物安全和细胞状态的基本方法。CCK8试剂盒，以WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）为作用底物，属于MTT方法的升级产品。在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。CCK8细胞增殖检测被广泛应用于药物筛选、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。CCK8方法的优势：1）酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰；2）细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。
1.1 细胞的选择：很重要！不同的实验目的需要不同的细胞系，药物效力或毒性研究选择合适的靶细胞和各组织细胞株系，细胞因子刺激实验需要选择生长依赖的细胞株。需要参考已有文献工作，结合实验目的选取适合细胞。
1.2 细胞培养条件准备：根据细胞的特性，确认细胞培养所用的培养基，血清，生长因子，培养温度和环境。
1.3 实验（+）对照样品准备。
1.4 根据实验目的设计合理的样品排板顺序，预留空白对照，（+）对照孔，所有样品需要准备实验复孔。
2.1.1 细胞培养和接种96孔板
2.1.1.1 吸弃原有细胞培养基，加入10ml PBS轻柔洗涤细胞，弃PBS。
2.1.1.2 加入3ml胰酶37度培养箱消化2-5 min，加入7ml完全培养基终止消化反应。
2.1.1.3 轻轻吹打均匀细胞，计数。
2.1.1.4 设计2-5个不同接种密度，取需要的细胞量加入合适体积的新鲜完全培养基重悬细胞。
2.1.1.5 每孔加入100μl细胞接种96孔板，放入37度，5% CO2培养箱培养过夜。
2.1.2 细胞增殖检测
2.1.2.1 细胞接种后24h，48h，72h，96h，120h分别检测CCK8增殖数据。
2.1.2.2 每孔加入10μL CCK8溶液，加入过程注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD读值。
2.1.2.3 将培养板在培养箱内孵育4小时。
2.1.2.4 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
2.1.3 绘制细胞生长曲线
2.1.3.1 计算每孔细胞吸光度=（每孔OD450nm-空白孔OD450nm），计算复孔的平均值和标准差。
2.1.3.2 以培养时间为横坐标，细胞CCK8数据为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2.2.1 细胞培养和接种96孔板
2.2.1.1 吸弃原有细胞培养基，加入10ml PBS轻柔洗涤细胞，弃PBS。
2.2.1.2 加入3ml胰酶37度培养箱消化2-5 min，加入7ml完全培养基终止消化反应。
2.2.1.3 轻轻吹打均匀细胞，计数。
2.2.1.4 根据细胞生长曲线实验选择最合适细胞密度接种，取需要的细胞量加入合适体积培养基重悬细胞。
2.2.1.5 每孔加入100μl细胞接种96孔板。
2.2.2 细胞因子刺激
2.2.2.1 用细胞培养基将细胞因子有限稀释，制备细胞因子系列浓度2x浓度工作液。
2.2.2.2 96板细胞培养板每孔加入100μl细胞因子工作液，轻轻摇匀。
2.2.2.3 将细胞放回37度，5% CO2培养箱培养。
2.2.3 细胞增殖检测
2.2.3.1 细胞接种后24h，48h，72h，96h，120h分别检测CCK8增殖数据。
2.2.3.2 每孔加入10μL CCK8溶液，加入过程注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD读值。
2.2.3.3 将培养板在培养箱内孵育4小时。
2.2.3.4 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
2.2.4 绘制细胞生长曲线
2.2.4.1 计算每孔细胞吸光度=（每孔OD450nm-空白孔OD450nm），计算复孔的平均值和标准差。
2.2.4.2 以培养时间为x轴，细胞CCK8数据为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
2.3.1 细胞培养和接种96孔板
2.3.1.1 吸弃原有细胞培养基，加入10ml PBS轻柔洗涤细胞，弃PBS。
2.3.1.2 加入3ml胰酶37度培养箱消化2-5 min，加入7ml完全培养基终止消化反应。
2.3.1.3 轻轻吹打均匀细胞，计数。
2.3.1.4 根据细胞生长曲线实验选择最合适细胞密度接种，取需要的细胞量加入合适体积培养基重悬细胞。
2.3.1.5 每孔加入100μl细胞接种96孔板。
2.3.2 药物孵育
2.3.2.1 根据药物理化特性准备合适溶剂，将药物配制约10mM储存溶液；准备溶剂对照和（+）药物对照。
2.3.2.2 用细胞培养基将药物有限稀释，制备药物系列浓度，准备2x药物浓度工作液。
2.3.2.3 96板细胞培养板每孔加入100μl药物工作液，轻轻摇匀药物和细胞培养液。
2.3.2.4 将细胞放回培养箱继续培养合适时间，常规48-72h。
2.3.2.5 每日观察细胞状态，记录不同药物作用下细胞表现。
2.3.3 细胞活力检测
2.3.3.1 每孔加入10μL CCK8溶液，加入过程注意不要在孔中生成气泡，以免影响OD读值。
2.3.3.2 （可选）用酶标仪测定在450nm处的吸光度，记录为药物背景OD450nm读值。
2.3.3.3 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
2.3.3.4 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。注意：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
2.3.3.5 活力计算：细胞活力（％）= [A(药物)-A（空白）]/[A（溶剂对照）-A（空白）] x 100%。
A（药物）：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
A（空白）：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
A（溶剂对照）：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。
